培养基

  • 基础培养基：葡萄糖1％，酵母膏1％，无水乙醇3％vol，pH 4 .5；
  • 分离培养基：基础培养基加入琼脂2％，碳酸钙2％，无水乙醇3％v01；
  • 斜面保藏培养基：基础培养基加入琼脂2％，碳酸钙1％，无水乙醇3％vol；
  • 产酸培养基：基础培养基经灭菌冷却后加入7％vol无水乙醇，分装250mL三角瓶，每瓶50mL 。

以上培养基均经过 121℃灭菌 20min；碳酸钙经过干热灭菌 (165℃、30min)。培养基灭菌结束后，待温度降至 70℃时加入碳酸钙和无水乙醇。

分离筛选流程及操作步骤

分离筛选流程

菌源制备 — 扩大培养 — 稀释分离 — 菌株纯化 — 斜面保藏 — 产醋酸定性试验 — 菌株初筛 — 菌株复筛 — 稳定性试验

操作步骤

1. 菌源制备

​将醋曲、腐烂苹果取少量用无菌生理盐水浸泡 1 小时后，进行扩大培养。

2. 扩大培养

​ 从自然发酵的苹果醋液、醋曲液、腐败苹果液中称取 10g 醋样于盛有 100mL 基础培养基的 500mL 三角瓶中，在 30℃、120r/​min 条件下振荡培养 48h。

3. 稀释分离

​ 取 1mL 培养液于盛有 9mL 无菌水的试管中，依次用无菌水稀释，获得最终浓度为 10-4、10-5、10-6 、l0-7 的培养液。分别取各浓度的稀释培养液 0.2mL，涂布法接种于分离培养基上，在 30℃培养 72h。从培养基上挑取菌落形态一致，透明圈大，菌落丰厚且生长优势的单菌落。

4. 菌株纯化

​ 将以上得到的单菌落在平板培养基上多次划线分离、培养、确认为形态一致的单菌落后，接种于斜面保藏培养基上，在 30℃培养 72h 后保藏于 4℃冰箱内。

5. 革兰氏染色

​ 将上述试管斜面上的菌株活化 2 次后革兰氏染色。

6. 产酸定性实验

​ 将上述斜面保藏菌种分别接种于含 3% vol 乙醇的基础培养基中，在 30℃浅层培养 72h 后，取 5ml 除去菌体的培养液，以 2.5mol/​l 的 NaOH 溶液中和 pH 值至 7.0，加入 5% Fe­Cl3 溶液 5 到 6 滴，形成红褐色沉淀者为产醋酸细菌。

7. 菌株初筛

​ 根据革兰氏染色和产酸定性试验得到的单菌落菌株，在平板培养基上进一步分离。根据其 HC 值（变色圈直径与菌落直径的比值）。

8. 菌种复筛

​ 将初筛菌种分别接种于产酸培养基上，每株 3 次重复，在 30℃静置培养 120h 后，测定酸度并比较。

9. 醋酸产量与酒精转化率的测定

醋酸产量测定：取 2ml 发酵液，加入 50ml 蒸馏水，3 至 5 滴 0.5% 酚酞酒精溶液，用标定的 0.1ml/​NaOH 溶液滴定至浅粉色，由消耗的 NaOH 溶液的体积来计算样品中的含酸量。

菌株分离筛选结果

革兰氏染色

食醋醋曲经稀释分离与反复划线后确定出 4 株形态一致的单菌落，斜面保存活化后进行革兰氏染色

产酸定性实验结果

按照产酸定性试验操作规程操作加入 5% Fe­Cl3 溶液

本文作者：mikusa

本文链接：https://www.himiku.com/archives/acetic-acid-bacteria.html

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